一、切片的高質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

組織切面完整，切片厚度適中，薄厚均勻，切片無刀痕，裂隙。切片平坦，無褶皺，折疊，切片無污染物，無氣泡，蓋玻片周圍無膠液外溢，透明度好，細(xì)胞核與細(xì)胞漿染色對比清晰。切片無松散，裱片位置適當(dāng)，切片整潔，標(biāo)簽端正黏貼牢固，編號清晰。

二、切片注意事項(xiàng)

1. 切片前要觀察切片機(jī)是否正常，各關(guān)節(jié)，鎖扣有無鎖緊。

2. 修蠟塊及切片應(yīng)勻速，過快會導(dǎo)致切片機(jī)震蕩，切片薄厚不均勻，速度過慢會導(dǎo)致切片增厚。

3. 切片應(yīng)完整，切片大小形狀應(yīng)與組織塊一致，切片的不完整，常會將重要病變遺漏。

4. 上蠟塊時應(yīng)注意查看組織包埋的方向，組織的層次，纖維，肌肉的走向應(yīng)向切片刀垂直，較難切的部分應(yīng)放在上面。

5. 注意毛刷，鑷子傷到切片刀口。

6. 切片應(yīng)用舊刀片修蠟塊，新刀片切片，切面應(yīng)保持清潔。

三、漂片

1. 漂片水溫：一般為42-45度之間，水溫不可低或高。

2. 漂片水的更換：漂片儀中的漂片水的更換，保持水面潔凈，并每日清潔漂片水槽四周內(nèi)壁石蠟組織，保持儀器清潔，用紗布清潔即可，注意動作輕柔，不要破壞內(nèi)壁涂層。

3. 漂片水的清潔：每切完一個蠟塊后，必須認(rèn)真清理水面，不得殘留其他病例的組織碎片，以免污染。具體方法為：可裁成水槽內(nèi)壁大小的漂片紙，撈片取材完畢后，即將裁好的漂片紙貼附水面，順一個方向拖動即可。

4. 漂片成功標(biāo)準(zhǔn)：切片自然舒展，平整無殘缺，無褶皺裂隙，易于撈片。

四、撈片

1. 玻片的選擇：常規(guī)染色，特殊染色，免疫熒光染色，選用的玻片不一樣。玻片要求表面清潔，透光性好，易于書寫號碼；免疫組織化學(xué)染色需選用特殊玻片，粘附性強(qiáng)。表面清潔，透光性好。

2. 撈片位置的選擇；組織應(yīng)該在撈片的中下1/3的位置中間。

3. 撈片數(shù)量的選擇，小組織撈取多一點(diǎn)，視情況而定，大組織一個即可，特殊要求按要求來，并且防止污染。

4. 撈片方向的選擇；組織方向應(yīng)與載玻片長軸方向一致，總體應(yīng)該遵循易于顯微鏡觀察為原則。

5. 撈片安全要求；漂片儀器中只可有一個蠟塊組織，嚴(yán)禁有兩個不同蠟塊的組織在同一個漂片儀內(nèi)。

6. 玻片號碼要清晰；應(yīng)仔細(xì)核對，防止出錯。

7. 撈片完成后按順序放入染色架中，注意防止放入時刮傷到組織，影響切片質(zhì)量。

五、冰凍切片

冰凍切片是免疫組織化學(xué)染色中常用的一種切片方法。其突出的優(yōu)點(diǎn)是能夠較完好地保存多種抗原的免疫活性，尤其是細(xì)胞表面抗原更應(yīng) 采用冰凍切片。新鮮的組織及已固定的組織均可作冰凍切片。

冰凍時，組織中水份易形成冰晶，往往影響抗原定位，一般認(rèn)為冰晶少而大時，影響較小，冰晶小而多時，對組織結(jié)構(gòu)損害較大，在含水量較多的組織中上述現(xiàn)象更易發(fā)生。冰晶的大小與其生長速率成正比，而與成核率（形成速率）成反比，即冰晶形成的數(shù)量愈多則愈小，對組織結(jié)構(gòu)影響愈嚴(yán)重。因此，應(yīng)盡量降低冰晶的數(shù)量。

冰凍開始時，冰晶成核率較慢，以后逐漸增加，其臨界溫度為-33。C, 從-30。C降至-43。C之間，成核率急劇增加達(dá)1018，然后再減慢?；谏鲜隼碚摽刹扇∫韵麓胧p少冰晶的形成。 

（1）速凍，使組織溫度驟降，縮短從-33。C---43。C的時間，減少冰晶的形成。其方法有二：

①干冰-酒精法：將150-200ml酒精裝入小保溫杯內(nèi)，逐漸加入干冰，直至飽和呈粘稠狀，再加干冰不再冒泡時，溫度可達(dá)-70℃C，用一小燒杯（50-100ml）內(nèi)裝異戊烷約50ml，再將燒杯緩慢置入干冰純酒精飽和液內(nèi)，至異戊烷溫度達(dá)-70℃時即可使用。將組織（大小為1cm×0。8cm×0。5cm）投入異戊烷內(nèi)速凍30-60s后取出，或置恒冷箱內(nèi)以備切片，或置-80℃低溫冰箱內(nèi)貯存。

②液氮法：將組織塊平放于軟塑瓶蓋或特制小盒內(nèi)（直徑約2cm），如組織塊小可適量加OCT包埋劑浸沒組織，然后將特制小盒緩緩平放入盛有液氮的小杯內(nèi)，當(dāng)盒底部接觸液氮時 即開始?xì)饣序v，此時小盒保持原位切勿浸入液氮中，大約10-20s組織即迅速冰結(jié)成塊。取出組織冰塊立即置入-80℃冰箱貯存?zhèn)溆?，或置入恒冷箱切片機(jī)冰凍切片。

（2）將組織置于20%-30%蔗糖溶液1～3天，利用高滲吸收組織中水分，減少組織含水量。影響冰凍切片的因素較多，因此，技術(shù)難度較大，選擇好的冰凍切片機(jī)是保證切片質(zhì)量的關(guān)鍵。

目前冰凍切片機(jī)有兩類：

①恒溫冰凍切片機(jī)（Cryastat）：為較理想的冰凍切片機(jī)，型號很多，但其基本結(jié)構(gòu)是將切片機(jī)置于-30℃C低溫密閉室內(nèi)，故切片時不受外界溫度和環(huán)境影響，可連續(xù)切薄片至2-4μm，完全能滿足免疫組織化學(xué)標(biāo)記要求。切片時，低溫室內(nèi)溫度以-15℃～18℃為宜，溫度過低組織易破碎，抗卷板的位置及角度要適當(dāng)，載玻片附貼組織切片，切勿上下移動。

②開放式冰凍切片機(jī)：包括半導(dǎo)體致冷切片機(jī)和甲醇致冷切片以及老式的CO2、氯乙烷等冷凍切片機(jī)。切片時暴露空氣中，溫度不易控制，切片技術(shù)難度 大，在高溫季節(jié) ，切片更加困難，且切片厚8～15μm，不易連續(xù)切片。

冰凍切片后如不染色，必須吹干，貯存低溫冰箱內(nèi)， 或進(jìn)行短暫預(yù)固定后貯存冰箱保存 。

六、石蠟切片

石蠟切片優(yōu)點(diǎn)是組織結(jié)構(gòu)保存良好，在病理和回顧性研究中有較大的實(shí)用價值，能切連續(xù)薄片，組織結(jié)構(gòu)清晰，抗原定位準(zhǔn)確。

用于免疫組化技術(shù)的石蠟切片制備與常規(guī)制片略有不同：①脫水、透明等過程應(yīng)在4℃下進(jìn)行，以盡量減少組織抗原的損失。②組織塊大小2cm×1.5cm×0.2cm，**以實(shí)驗(yàn)情況為主，使組織充分脫水、透明、浸蠟。③浸蠟、包埋過程中，石蠟應(yīng)保持在60℃以下，以溶點(diǎn)低的軟蠟**（即低溫石蠟包埋）。

以上全過程為18-24h，也可在室溫內(nèi)使用自動脫水機(jī)代替。如組織塊小， 直徑小于0。5cm，可用快速石蠟包埋切片，全過程只需4h左右。石蠟切片為常規(guī)制片技術(shù)，切片機(jī)多為輪轉(zhuǎn)式，切片厚度2～7μm，應(yīng)用范圍廣，不影響抗體的穿透性，染色均勻一致。

由于甲醛固定、有機(jī)熔劑和包埋劑對組抗原有一定的損害及遮蔽，使抗原特征發(fā)生改變。有人報(bào)告經(jīng)蛋白酶消化，可以改善光鏡免疫組化染色強(qiáng)度，常用的有胰蛋白酶、鏈霉蛋白酶及胃蛋白酶等消化法。石蠟切片應(yīng)入37℃恒溫箱過夜，這樣烤片可減少染色中脫片現(xiàn)象。切片如需長期貯存，可存放于4℃冰箱內(nèi)備用。

石蠟切片優(yōu)點(diǎn)較多，但在制片過程中要經(jīng)過酒精、二甲苯等有機(jī)溶劑處理，組織內(nèi)抗原活性失去較多，有人采用冷凍干燥包埋法（Freeze drying embedding methed），可以保存組織內(nèi)可溶性物質(zhì)，防止蛋白變性和酶的失活，從而減少了抗原的丟失。

該法是將新鮮組織低溫速凍，利用冷凍干燥機(jī)（Freezing dryer）在真空、低溫條件下排除組織內(nèi)水分 ，然后用甲醛蒸氣固定干燥的組織，之后將組織浸蠟、包埋、切片。此法可用于免疫熒光標(biāo)記、免疫酶標(biāo)記及放射自顯影。