病理實驗制片過程中，我們經(jīng)常會遇到含鈣高的組織，因其組織結(jié)構(gòu)質(zhì)地太硬，組織中存有的鈣鹽會妨礙使用常規(guī)方法制作良好切片，經(jīng)固定后，必須除去鈣鹽使組織軟化，方能進行常規(guī)切片。骨組織含鈣量多，所以脫鈣是制作骨組織切片的重要環(huán)節(jié)，尤其需要進行免疫組化的骨組織。為了達到骨組織既充分脫鈣，又保護骨組織的抗原不受破壞，需對骨組織固定之后再脫鈣或采用兼有固定與脫鈣的試劑處理，然后才能常規(guī)制片。

一、骨脫鈣方法

常見的脫鈣方法主要有單純酸類脫鈣法、混合酸類脫鈣法以及有機螯合劑法。

單純酸類脫鈣法：

主要有甲酸、硝酸、鹽酸等，硝酸和甲酸應用多。

①   甲酸是一種使用范圍較廣的脫鈣劑，濃度一般10%，脫鈣速度較慢，適合骨髓組織脫鈣，不適合皮質(zhì)骨的脫鈣。

②   硝酸脫鈣液缺點是形成亞硝酸而使溶液呈黃色，產(chǎn)生顏色即迅速影響脫鈣速度，且組織的黃染會妨礙隨后的染色，可在硝酸內(nèi)加入0.1%尿素可以防止變黃而使之無色。

③   鹽酸脫鈣液易使組織收縮，作用速度較快，用氯化鈉作為溶劑則效果良好。

①   含甲酸脫鈣液（甲酸-福爾馬林液）

配方：甲酸                 5－25ml

        福爾馬林            5ml

        蒸餾水     加至    100ml

5%的甲酸是良好的一種常規(guī)脫鈣劑，速度適當，組織損害小。當甲酸成分增至25%則增快脫鈣速度，加入甲醛可適當保護組織不受酸損害（注意：增加脫鈣速度只能靠消耗細胞微細構(gòu)造來獲得）。根據(jù)組織的厚度和鈣化程度，5%甲酸在2至4天可以完全脫鈣。

②   含鹽酸脫鈣液（Von Ebnei氏液）

配方：濃鹽酸             15ml

氯化鈉             7.5ml

蒸餾水    加至   100ml

③   含硝酸脫鈣液

配方1：福爾馬林              5ml

          硝酸（比重1.41）  7.5－15ml

          蒸餾水    加至       100ml

此配方中甲醛可以部分抑制硝酸的浸軟作用，同時具有固定作用，硝酸脫鈣迅速，組織不膨脹，掌握好可以直接脫水，不影響染色。不過應該先洗去硝酸。

配方2：硝酸（用0.1尿素穩(wěn)定）   5－10ml

           蒸餾水           加至       100ml

此配方用作常規(guī)脫鈣劑，作用迅速，對組織不膨脹，對細胞的保存和染色比前者更好，能適用于多種染色技術(shù)，但盡量每日早晚更換一次新鮮溶液，一般1-3天完成。

④   螯合劑脫鈣

EDTA（乙二胺四乙酸）是用于脫鈣的螯合劑。為有機化合物，有結(jié)合某些金屬的能力，能結(jié)合鈣鹽，15%的溶液即起脫鈣作用，組織用此方法脫鈣，對組織破壞性小，即放置數(shù)月亦不致引起對組織的破壞，對以后大多數(shù)的染色技術(shù)皆可得到滿意結(jié)果。

二、骨脫鈣步驟

1.取材：將骨組織固定于10%福爾馬林24小時后再鋸取厚度約0.5厘米骨片。

2.固定：再以10%福爾馬林固定2天。

3.將組織置于脫鈣劑中，每日更換新鮮液、直至組織軟化為止。

4.流水沖洗24小時/2%亞硫酸鈉水溶液中和，至少3小時，水洗至少1小時（除酸）。

5.進行常規(guī)脫水，透明，浸蠟，切片。

三、鑒定脫鈣是否徹底

確定脫鈣“終點”有以下三種方法：

1. 常用的簡單方法――針刺，如果很容易被刺透，而且不感到阻力時，說明組織基本上脫鈣完全，否則應繼續(xù)脫鈣。

靠組織的柔軟性測驗脫鈣作用靠不住，而且這種插入一根針以察覺鈣沉淀的方法會造成組織損傷。

2．用X射線檢查：看組織內(nèi)是否仍有鈣質(zhì)。

3．用化學實驗檢查

取5ml脫鈣液用2M的NaOH（氫氧化鈉）調(diào)整至中性，再加5％草酸鈉或草酸銨1ml，液體混濁表示有鈣質(zhì)。遲至5分鐘仍不混濁表示脫鈣液中不含有鈣質(zhì)。

組織中仍有鈣質(zhì)時，一定量的鈣離子會溶于脫鈣液中，游離的鈣會干擾脫鈣作用的完成。顯然，應在每次試驗時完全更換，在試驗中必須經(jīng)過2－3小時間隔讓鈣溶解。

四、高質(zhì)量脫鈣劑的標準

（a）完全脫鈣；

（b）不損傷組織細胞或纖維；

（c）不妨礙以后的染色技術(shù)；

（d）適當?shù)拿撯}速度。