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免疫藍圖中淋巴細胞網(wǎng)絡是動態(tài)的細胞群

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2024-11-07 09:02:41南京弗瑞思生物科技有限公司7

本文亮點：

1.多重免疫熒光揭示肺腺cancerKP（Kras/Trp53）GEMM小鼠模型中淋巴細胞網(wǎng)的相互作用；

2.小淋巴網(wǎng)以T細胞為主，B細胞比例隨著淋巴網(wǎng)擴大而增加；

3.淋巴網(wǎng)的關鍵特征是他們含有TCF1+ PD- 1+ CD8+細胞的祖細胞；

4.免疫診療后淋巴細胞獲得細胞毒性CD8+ T細胞。

多色免疫熒光應用（CyCIF） :

24個蛋白循環(huán)染色：B220 ；CD45；FOXP3；CD4；CD8a；CD103；CD11c；CD11b；Nkp46；CD3e；Ki-67；PD-L1；PD-1；Granzyme B；Perforin；TIM3；Ly6G；TCF1；Vimentin；aSMA；F4/80；Pan-Keratin；PCNA；TTF1。

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研究背景

BACKGROUND

在cancer進展過程中，免疫細胞增殖、遷移和適應以試圖阻止Tumor擴散；Tumor細胞通過誘導抑制免疫細胞功能的程序來應答；因此，描述免疫細胞的功能狀態(tài)及其相對于Tumor細胞的空間特征，以識別抗Tumor免疫的特征尤為重要。本文通過Kras/ trp53突變（KP）肺腺cancer模型，將慢病毒編碼的Cre重組酶導入Kras /Trp53小鼠。在KP模型的LucOS變體中，引入卵清蛋白的SIIN和合成肽SIY，兩種模型CD8+ T細胞抗原，KP-Cre與LucOS相比，LucOS小鼠顯示Tumor中CD8+ T細胞的數(shù)量有效增加。

雖然多種解離的單細胞方法可以深入了解模型動物中Tumor發(fā)生和免疫監(jiān)視，但這些方法缺乏關于細胞間相互作用和細胞群位置的關系。常規(guī)病理實驗并不能提供精確的詳細分子信息。本研究作者使用多重免疫熒光技術來表征KP-LucOS中Tumor-免疫相互作用的空間特征，包括當趨化因子介導的運輸被調節(jié)時，以及免疫診療后的空間特征。

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研究內容

RESEARCH QUESTION

作者建立小鼠肺cancer模型后并進行免疫診療；進行HE、CyCIF、RNAscope實驗，HE染色進行形態(tài)觀察和注釋，CyCIF染色鑒定多種細胞類型和進行后續(xù)空間特征分析，RNAscope從轉錄豐度上表征相關細胞因子的水平及相關性，基于多模態(tài)整合數(shù)據(jù)進行隊列分析，Tumor特征分析，免疫特征空間分析等挖掘Tumor微環(huán)境空間特征。

Tumor抗原表達重組KP肺cancer的免疫景觀:在KP Cre和KP LucOS中以8周為時間點，被染后8周HE及CyCIF展示LucOS小鼠的Tumor負荷有效低于Cre小鼠。當整個肺組織作為一個整體，LucOS小鼠中免疫細胞差異不明顯。劃分Tumor區(qū)域后顯示髓樣細胞在Tumor邊緣更豐富，但沒有浸潤到Tumor中，LucOS模型中以與淋巴細胞相似的空間模式更容易浸潤到Tumor內。

抗原表達與淋巴細胞網(wǎng)絡是否存在Tumor內定位相關：在Cre和LucOS小鼠中，B、T細胞的比例與淋巴結大小呈相關性；小淋巴網(wǎng)T細胞多，大淋巴網(wǎng)B細胞增加并呈線性上升；說明以T細胞為主要隨后招募B細胞生長。LucOS淋巴網(wǎng)中Treg減少細胞毒性T細胞增加。熱圖顯示在Cre小鼠中，大多數(shù)淋巴細胞位于Tumor外部，而在LucOS肺中，大多數(shù)淋巴細胞位于Tumor內部。這些發(fā)現(xiàn)揭示了T細胞抗原表達可能與抑制Tumor生長有關。

CXCR3配體調節(jié)淋巴網(wǎng)形成和大小，但不調節(jié)Tumor內定位：CyCIF 和 RNAScope連續(xù)切片染色結果顯示，與Cre小鼠相比，LucOS小鼠肺組織中Cxcl 9和Cxcl 10 mRNA水平適度增加，B和T細胞更靠近LucOS小鼠中的Cxcl 9和CxcllO陽性細胞，而且免疫群體主要存在于淋巴網(wǎng)內。淋巴細胞屬于淋巴網(wǎng)的可能性與到近的Cxcl 9或CxcllO陽性細胞的距離負相關。

空間分析揭示了免疫診療后TC細胞狀態(tài)的動態(tài)變化：作者建立了2種免疫細胞診療（Vax和ICB）的模型，利用多維表達數(shù)據(jù)模擬單細胞分化軌跡，用6個Marker標記細胞毒性T細胞分為3個不同的狀態(tài)（S1狀態(tài)對應于初始T細胞狀態(tài)；S2表示增殖性細胞毒性T細胞狀態(tài)。S3表示耗竭的T細胞狀態(tài)。），隨后分析在Tumor中的位置：Vax小鼠S2 A狀態(tài)在Tumor遠端發(fā)現(xiàn)，S2 B（Vax）和S2（ICB）狀態(tài)在Tumor內富集，S3群體被發(fā)現(xiàn)靠近Tumor邊緣。Vax和ICB診療均未有效改變過渡表型的CD8+ T細胞。在Vax中，T2細胞在Tumor內富集，并且富集共表達TCFl和PD-I的細胞?？傊?，TCF1+ PD-1+祖細胞CD8+ T細胞富集在特定的過渡狀態(tài)，可有效地轉移到Tumor中并駐留。

TCF1+ PD-1+CD8+ T祖細胞位于Tumor淋巴網(wǎng)內：作者又分析了淋巴細胞中T細胞不同亞型占比及富集分析，淋巴細胞中Tc細胞的總數(shù)與TCF1+ PD-1+細胞的數(shù)量線性相關；淋巴細胞的Tc區(qū)室也主要由含有TCF1+PD-1+祖細胞的過渡T2狀態(tài)組成。免疫診療后，具有細胞毒性潛能的細胞與TCF 1+PD-1+祖細胞共定位在淋巴網(wǎng)中。之后作者推測一個模型：Tc細胞在從TCF1+S1狀態(tài)分化成T2 TCF1+PD-1+狀態(tài)時迀移到Tumor內淋巴網(wǎng)中；ICB和Vax免疫療法促進TCF1+PD-1+細胞在Tumor內分化為細胞毒性S2 B狀態(tài)，然后這些細胞在抑制性受體上調和細胞毒性活性下調后進展為T細胞耗竭S3狀態(tài)。

TCF1+ PD-1+CD8+ T祖細胞富集的淋巴網(wǎng)在早期人類肺腺cancer中富集：作者之后又檢測了14例早期人肺腺cancer患者的樣本進行對比。人Tumor中的淋巴網(wǎng)同小鼠類似大多數(shù)是小的淋巴網(wǎng)，T細胞逐漸下降B細胞逐漸增加，這些發(fā)現(xiàn)表明，早期人類和小鼠肺cancer的抗cancer免疫反應的特征是小淋巴細胞網(wǎng)絡占優(yōu)勢。Tc細胞鑒定祖CD8+ T細胞的TCF 1和PD-1共表達群體時，Tc細胞存在于淋巴網(wǎng)的外部和內部，但TCF1+ PD-1+祖細胞主要存在與淋巴網(wǎng)，并且隨著淋巴網(wǎng)尺寸增加而增加。

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結論

CONCIUDE

本研究在小鼠肺cancer模型和人肺cancer中出現(xiàn)的淋巴網(wǎng)的特征進行深入解析：淋巴網(wǎng)聚集的大小與T細胞/B細胞的數(shù)量及空間分布及發(fā)現(xiàn)TCF1+ PD-1+ CD8+T祖細胞位于Tumor內部對淋巴細胞抗Tumor作用的全新詮釋，以更好的解釋淋巴網(wǎng)產(chǎn)生支持CD8+ T細胞抗Tumor應答的空間環(huán)境的分子機制。

摘要翻譯：

淋巴細胞是Tumor免疫監(jiān)視的關鍵，但我們對促進淋巴細胞抗Tumor功能的空間特征了解有限。作者使用多重免疫熒光技術、定量及空間分析和機器學習創(chuàng)建了Kras/ trp53突變小鼠模型和人類切除的肺部Tumor的高清空間特征。相互作用的淋巴細胞網(wǎng)絡（“淋巴網(wǎng)”）作為抗cancer免疫反應的一個有效特征。由小T細胞聚集成簇成主要，并隨著體積的增加B細胞增加。cxcr3介導的轉運調節(jié)淋巴細胞的大小和數(shù)量，但T細胞抗原的表達指導Tumor內定位。淋巴細胞優(yōu)先攜帶參與免疫檢查點阻斷（ICB）診療應答的TCF1+ PD-1+祖細胞CD8+ T細胞。在使用ICB或抗原靶向疫苗診療的小鼠中，淋巴細胞保留了祖細胞并獲得了細胞毒性CD8+ T細胞群，這可能是通過祖細胞分化實現(xiàn)的。這些數(shù)據(jù)表明，淋巴細胞創(chuàng)造了一個支持CD8+ T細胞抗Tumor反應的空間環(huán)境。